在之前的文章中，我们已经探讨了慢病毒的包装和细胞系构建。慢病毒具备将外源基因高效整合至宿主染色体的能力，从而实现长期表达。这种病毒能够有效感染几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞以及原代细胞，因而成为基因传递的一种强大且有效的工具，广泛应用于生物医药领域。了解慢病毒的包装过程后，当我们获得包装好的慢病毒后，接下来的操作步骤该如何进行呢？接下来，我将详细分享拿到慢病毒后的具体操作步骤，内容丰富，值得关注！

1. 病毒的储存

包装好的慢病毒建议分装后存放在-80℃冰箱中，储存期限通常为半年。若超过这一期限，使用前应重新测定病毒滴度。若在短时间内（3-5天）需要实验，也可将其放置在4℃保存。同时，在病毒使用过程中，应尽量避免反复冻融，因为冻融会降低病毒滴度，因此可以根据每次实验的用量提前分装。

2. 病毒的稀释

如需对病毒进行稀释，建议先将病毒在冰浴中融化，然后用PBS或不含血清的培养基混匀稀释，最后储存于4℃。为了确保病毒滴度的稳定性，建议在3天内使用完毕。

3. 预实验摸索慢病毒的最佳MOI

不同细胞对慢病毒的敏感性有所不同，且各慢病毒载体的荧光强度也存在差异。因此，在正式实验之前需通过预实验确定慢病毒对细胞的感染复数（multiplicity of infection，MOI）及最佳感染条件，例如接种细胞的数量、感染时的总体积和培养基的更换时间。这样可以确保正式实验能达到理想效果，并依据MOI与细胞数量计算后续实验所需的病毒量。

感染预实验步骤：

第1天：将生长状态良好的目的细胞以1x10⁴个/孔接种于96孔板中，放置于37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜。接种细胞的数量可能因细胞生长速度的不同而略有差别，一般要求第2天细胞密度在30-50%左右。

第2天：根据实验需求或文献中参考的MOI值设置梯度范围，通常为3-100。将-80℃冰箱取出的病毒冰浴融化，假设病毒滴度为1x10⁸ TU/mL，根据MOI为5、10、30、50、100的梯度计算，每孔需要加入的病毒原液分别为0.5μL、1μL、3μL、5μL和10μL。根据每孔需要加入的病毒原液和复孔数准备病毒稀释液，确保每孔的体系为100μL。同时，可以设计包含Polybrene的实验组以及空细胞组作为对照。

第3天：更换培养液，通常在感染16-24小时后，将含有慢病毒的培养液替换为正常培养基，继续培养细胞。

第4-5天：检测感染效率，使用倒置荧光显微镜观察感染48-72小时后的荧光，并拍摄照片。对比细胞的明场及荧光状态，估计慢病毒感染目的细胞的效率，最终确定合适的MOI值用于正式实验。

4. 慢病毒感染目的细胞

在确认了慢病毒对靶细胞的亲和性及合适的MOI值后，可以进行正式感染实验。以使用GFP荧光标记和Puromycin抗性的慢病毒感染细胞为例，具体步骤如下：

1. 第一天：根据实验需求将细胞铺板，24孔板一般以5-10x10⁴个细胞/孔的密度接种，第二天细胞密度应达到约50%，放置于37℃培养过夜。
2. 第二天：感染前，从-80℃冰箱取出病毒冰浴融化，根据预实验得到的MOI值用新鲜完全培养基将病毒稀释成所需浓度，轻轻混匀。
3. 吸去细胞的原有培养基，并将按照MOI稀释好的病毒液加入细胞中。如果需要，可根据预实验结果添加Polybrene（如果对细胞没有影响，Polybrene可以与病毒原液一起加至培养基中，轻轻摇匀，37℃培养过夜）。
4. 感染16-24小时后，吸除含慢病毒的培养基，换入新鲜培养基。具体感染时间可参考预实验中观察到的慢病毒对细胞状态的影响。
5. 继续培养48-72小时后，根据需要收集细胞以检测目的蛋白的表达。

5. 目的细胞稳转株的构建

（1）抗生素筛选：使用不同抗性的慢病毒成功感染细胞后，感染的细胞能够在含一定浓度相应抗生素的培养基中存活，而未感染的细胞则无法生存。因此在抗性筛选压力下，可以成功筛选出稳定表达目的基因的细胞株。例如，带有Puromycin抗性的慢病毒在感染48-72小时后（细胞汇合度达到70-80%），继续培养于含适量Puromycin的培养基中，每3-4天更换一次，直至未感染的对照组细胞消失，而感染的细胞组仍保持存活（如病毒载体带有荧光标记，荧光效率需达到100%）后，再进行多克隆及单克隆稳转株的筛选。

（2）稳转株的构建及保存：

1. 多克隆稳转株筛选：将抗生素浓度降低至维持浓度（筛选浓度的1/2，即半致死浓度）以抑制未感染细胞继续生长，继续筛选和扩增感染后的细胞，同时采集细胞进行qPCR或Western Blot鉴定目的基因的表达水平。鉴定结果正常的细胞则可冻存保种。
2. 单克隆稳转株筛选：筛选后的细胞进行稀释培养，挑取单个细胞成长为细胞克隆，随后进行扩大培养，以获得性状单一、表达稳定的细胞株。采用有限稀释或流式分选等方式接种于96孔板，接种细胞密度为1个细胞/孔。标记具有单个细胞的孔，抗生素浓度降低至维持浓度，继续筛选和扩增。扩增完成后，收集细胞进行qPCR或Western Blot确认表达水平，并选择正常的单克隆细胞进行冻存保种。

在以上操作过程中，需要特别注意不同细胞群的依赖性，可能由于细胞密度的影响导致单个细胞无法正常增殖，因此在进行单克隆筛选前，建议先用空细胞开展预实验，以确保其能够正常增殖分裂。

通过这样的操作流程，我们不仅能够有效地利用慢病毒进行基因传递，还能够打造适用于各种生物医药研究的稳转细胞株，为实际实验提供可靠的基础人生就是博-尊龙凯时。