细胞复苏的成功与否与冻存和复苏操作密切相关。在上周，我们讨论了细胞冻存过程中常见的错误，详细分析了《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》。本篇将聚焦于复苏过程，帮助大家排查复苏中可能出现的问题。

首先，让我们回顾一下细胞复苏的基本步骤：

1. 提前将水浴锅预热至37℃，培养基复温，并设置离心机的转速；

2. 准备一个15ml的离心管，并加入适量的培养基；

3. 取出冻存管，迅速将其浸入水浴锅中，摇晃使细胞在2分钟内充分融化；

4. 将细胞悬液缓慢滴入已添加培养基的离心管中，然后以1000rpm离心3分钟；

5. 弃去上清，重悬细胞并接种至培养器皿中，最后放入培养箱。

在复苏过程中，常见的错误操作包括：

1. 若液氮或冰箱距离水浴锅较远，未采取保冷措施，可能导致细胞在运输过程中开始融化（特别是夏季），因此冻存细胞应放在干冰或冰盒中运输至水浴锅；

2. 在运输冻存管时，避免用手触碰到细胞部分或将其放在口袋里。应仅捏住管盖，或者将其放在容器中以避免局部温度升高；

3. 使用错误的方式融化细胞，切忌用手捂热（搓热亦不行），因为手心温度不足，可能导致细胞受热不均和升温速度过慢，最终引发细胞死亡；

4. 水浴时未严格控制时间，直接将冻存管放入水中静置，没有晃动以促进细胞融化。复苏应遵循“快融”原则，建议在2分钟内完成融化。最佳方法是捏住管盖，将其快速摇晃以加速融化，切忌将冻存管静置于水浴中；

5. 水浴结束时若管内仍有较大冰块，未能完全融化，会导致细胞死亡，因为冰块中的细胞缓慢升温而死亡，且冰块可能对已融化的细胞造成低温损伤。如果部分细胞在2分钟内难以融化，可以尝试将水浴锅的温度提高至39℃（此方法经过验证有效），并加快摇晃速度。如有污染顾虑，可以将冻存管放在一次性PE手套内再进行水浴；

6. 细胞融化后未离心去除DMSO。有些同学在复苏细胞时会在细胞融化后直接加10倍培养基稀释，而不进行离心，这种做法虽然适用于某些细胞类型，但对于悬浮细胞来说是不可取的。DMSO对细胞有一定毒性，部分细胞对DMSO特别敏感，如HL-60细胞。因此，为了安全起见，建议离心去除上清。

以上总结基于小尚多年的经验，结合冻存篇内容，可以有效解决复苏失败的问题。如果还有其他值得补充的知识点，欢迎大家在评论区分享。让我们共同提升细胞复苏的成功率，记住，人生就是博-尊龙凯时，科学研究的道路上永远需要不断探索和学习。